Реферат ВИЗНАЧЕННЯ ЧУТЛИВОСТІ ЗБУДНИКА АКТИНОМІКОЗУ - ACTINOMYCES BOVIS ДО АНТИБІОТИКІВ
Реферат ВИЗНАЧЕННЯ ЧУТЛИВОСТІ ЗБУДНИКА АКТИНОМІКОЗУ - ACTINOMYCES BOVIS ДО АНТИБІОТИКІВ
Актиномікоз – захворювання, обумовлене різними видами актиноміцетів, в основі якого лежить грануломатозне пошкодження тканин і органів, що характеризується розвитком щільних інфільтратів і утворенням свищів.
Дане захворювання характерно як для людини, так і для тварин і проявляється в різних клінічних формах. Збудником актиномікозу є анаеробні й аеробні види актиноміцетів. Уважається, що патогенними для людини й тварин є тільки анаеробні види актиноміцетів - A. israelii (для людини) і A. bovis (для тварин). Однак деякі дослідники, у тому числі вітчизняні автори [1,2,3], виділяють як збудників і аеробні види.
Незважаючи на те, що це захворювання відоме вже давно, але в наш час, як і раніше при лікуванні актиномікозу великої рогатої худоби широко застосовуються хірургічні методи, такі як розкриття актиномікоми, часткова або повна її екстирпація. Поряд з хірургічними методами застосовуються і йодотерапія (спиртові розчини йоду, йодистий калій). Лікування йодистими препаратами (йодистий калій) уперше запропонував Томассен в 1885 р.[4]. Питання про те, як діють йодисті препарати на актиномікозний процес, пояснюється не мікоцидними властивостями препарату проти збудників актиномікозу, а впливом на клітини й підвищення захисних сил макроорганізму. У деяких випадках йодисті препарати застосовуються й у медичній практиці, однак, на думку В. Л. Осповата, це лікування є більше традиційним, чим ефективним [5].
Застосування антибіотиків при актиномікозі також має досить довгу історію. Уперше антибіотик (пеніцилін) був застосований Кифером в 1943 р. при актиномікозі людини [6]. Починаючи із цього періоду багато дослідників вивчали чутливість збудника актиномікозу до різних груп антибіотиків: стрептоміцину, пеніциліну, тетрацикліну, канаміцину, неоіицину, эритроміцину [7, 8 ,9 ,10]. Отримані при цьому результати не завжди носили позитивний характер [11].
З однієї сторони це пояснюється значною мірою труднощами культивування культури актиноміцетів (їхнім повільним ростом), а також тим, що при визначенні чутливості дослідники користувалися різними методиками й різними живильними середовищами до складу яких нерідко входили речовини, що продуцюють, руйнуючі антибіотики. З іншого боку, швидше за все, впливає множинна лікарська стійкість, звичайно властива мікроорганізмам, виділюваним з таких джерел, які піддавалися антибіотикотерапії, наприклад з організму людини й тварин.
Проаналізував літературні дані відносно антибіотикотерапії актиномікозу великої рогатої худоби, ми вирішили у своїй роботі використати антибактеріальні препарати, які досить рідко використаються при лікуванні великої рогатої худоби в окремо взятому господарстві. У цьому випадку, таким господарством виявилася сільськогосподарського підприємства «Україна» Красногвардійського району автономної республіки Крим.
Після проведення клінічного огляду поголів'я великої рогатої худоби (1275 голів), було виявлено 98 тварин хворих актиномікозом, з різною локалізацією актиномиком (табл. 1).
Таблиця 1
Локалізація актиномиком у великої рогатої худоби
|
№
|
Локалізація актиномікозу
|
Кількість голів
|
%
|
|
1
|
Усього хворих
|
98
|
100
|
|
2
|
В області нижньої щелепи
|
77
|
78,6
|
|
3
|
В області верхньої щелепи
|
16
|
16,4
|
|
4
|
Міжщелепний простір
|
2
|
2
|
|
5
|
В області навколовушної слинної залози
|
3
|
3
|
Судячи з таблиці, співвідношення між різними локалізаціями процесу при актиномікозі значно варіює. Переважно актиномікоми локалізуються в області нижньої щелепи, що становить 78,6% від всіх локалізацій. Локалізація актиномиком в області верхньої щелепи 16,4%.
Також нами було проаналізовано локалізації актиномиком великої рогатої худоби залежно від віку (табл. 2). Під час проведення клініко-епізоотичного обстеження великої рогатої худоби, при виявленні актиноміком та їхнє розташування, ми керувалися клінічною класифікацією актиномікоза щелепно-лицьової області великої рогатої худоби [12]. Перевагою цієї класифікації, є те що вона базується насамперед на петогенетичних факторах цього захворювання.
Численні дослідження показують, що найбільш частим, а найчастіше й основним є ендогенний шлях проникнення інфекції. Це стосується актиноміцетів, які є нормальними мешканцями слизової оболонки порожнини рота, верхніх дихальних шляхів і шлунково-кишкового тракту людини й тварин. Вони також можуть бути виявлені в зубних нальотах, зубному камені, у криптах мигдалин, порожнинах каріозних зубів, а також серед мікрофлори слини. У проведених експериментах, коли проводилося щеплення актиноміцетів, виділених з каріозної порожнини зуба людини, здоровим телятам, то в останніх спостерігалося захворювання актиномікозом [13].
Травми різної етиології, ушкодження тканин і запальні процеси слизової оболонки порожнини рота, ясен, кишечнику. Поряд зі зниженням опірності, реактивності й падінням захисних, імунних сил організму сприяють переходу актиноміцетів із сапрофітичного стану в паразитичне. Так, на думку Г. О. Сутеева (1951), значну роль у патогенезі актиномікозу відіграє вторинна, найчастіше піококкова інфекція, що підсилює грійний процес і сприяють розвитку сенсибілізації організму до актиноміцетів і продуктів їхньої життєдіяльності [3].
За результатами проведеного аналізу було встановлено, що найчастіше вражається молоде поголів'я великої рогатої худоби до 3 років, після цього віку спостерігається тенденція до зниження кількості хворих тварин. Причому основним місцем локалізації актиноміком є області нижньої щелепи (80,8-81,4% від всіх локалізацій) і в області верхньої щелепи (15,4-18,6% від всіх локалізацій) у віці до 3 років. Швидше за все, це можна пояснити тим, що шкірний покрив в області шиї та в міжщелепному просторі у молодих тварин ніжний і легко травмується виступами й гострими краями годівниць, грубими нашийниками для прив'язі. Крім цього, причиною виникнення актиноміком в області нижньої щелепи, верхньої щелепи з поразкою кісткової тканини (два випадки: в однієї тварини у віці до 1 року й в одного у віці двох років) є зміна зубів у тварин і стоматити різного походження.
Після проведення клініко-эпізоотичного обстеження поголів'я у двох тварин був відібраний патологічний матеріал (вміст актиномікоми), для проведення ряду досвідів по визначенню активності антибактеріальних препаратів.
В основі визначення лежить біологічний метод, сутність якого зводитися до нижченаведеного:
1. Встановити збудника захворювання (бактеріологічні дослідження).
2. Перевірка чутливості (резистентності) виділеного виду мікроба до антибіотика.
Бактеріологічні дослідження у свою чергу підрозділяються на :
1. Виділення чистої культури з первинної сировини (гній, слиз, кров, шматочки тканин і т. д.):
1.1. Постановка біопроби на лабораторних тваринах;
1.2. Методом послідовних пересівань на живильних середовищах;
2. Виділена чиста культура інокулюється лабораторним тваринам (експериментальне відтворення захворювання).
3. Повторне виділення збудника з організму тварини й посів його на живильні середовища.
Виділення й ідентифікація збудника захворювання. Матеріалом для дослідження служили хворі актиномікозом тварини, що належать СПК «Україна» Червоногвардійського району АР Крим. Экстирпированные актиномікоми були взяті для бактеріологічного дослідження, піддані мікроскопії, фарбуванню по Граму й простим методом з наступним висівом на живильні середовища Первинний посів вироблявся із гною, узятого з актиноміком на МПА, МППБ агар Сабуро. Колонії актиноміцетів досліджувалися макроскопічно та мікроскопічно. Морфологічні особливості вирощених нами культур актиноміцетів були наступні: у мазках, приготовлених з культур, вирощених на МПА, МППБ і агарі Сабуро, виявлявся добре виражений одноклітинний несептированный міцелій, що складається з розгалудженних тонких ниток різної довжини розмір яких у поперечному перерізі не перевищую 0,6-0,7 мікрона. Міцелій добре офарблювався по Граму.
При розвитку на МППБ виділені нами актиноміцети утворять дуже щільні колонії шкірястої консистенції, важко захоплюються бактеріологічною петлею. Вони зросталися із середовищем гіфами міцелію і як би вростали в агар. Перший день вони мали сірувато-білий або палевий цвіт, за винятком культури, виділеної від одного із тварин, що мала желтоваточкоричневую фарбування.
Колонії культур без пігменту через 2-3 дні покрилися повітряним білувато-сірим міцелієм. Колонії, що мали жовтувато-коричневий відтінок, теж покрилися нальотом, але лише по краях живильного середовища
Виділені нами колонії актиноміцетів по культуральным властивостях можна було підрозділити та три групи. Перша група - актиноміцети, які давали па агарі дрібні й середньої величини колонії - овальні, горбисті й щільнозростаються з живильним середовищем На другий і третій день вони ставали опуклими й здобували жовтувато-коричневий цвіт. У процесі наступної культивації на них з'являлися дочірні колонії. У міру подальшого дозрівання колонії покривалися білим нальотом, що нагадував собою пушок або гіпс.
При культивуванні в мясопептоно-печеночном бульйоні ця група колоній актиноміцетів давала на дні пробірки незначний пластівчастий осад, що розбивався при струшуванні на окремі пушинки. При цьому бульйон залишався прозорим. Ніякої плівки на поверхні бульйону не утворювалося.
Актиноміцети другої групи на поверхні м’ясопептонного агару росли у формі великих округлої форми колоній, зросшихся з живильним середовищем На другий і третій день росту вони ставали опуклими, горбистими, кратерообразными й покривалися білосніжним нальотом.
Актиноміцети другий, групи на мясопептонно-печеночном бульйоні утворювали на дні пробірки пухкий пластівчастий осад, що важко розбивався при струшуванні. Деякі культури цих актиноміцетів утворювали в пробірці пристеночное кільце. Сам бульйон залишався прозорим.
Культури актиноміцетів третьої групи на мясопептонно-печіночному бульйоні давали округлої форми колонії, з пологими краями й кратерообразными поглибленнями в центрі. На другий і третій день вони вже щільно зросталися з живильним і важко відокремлювалися від неї. При цьому вони покривалися білуватим нальотом. На п'ятий і шостий день на поверхні колоній з'являлися крапельки прозорої рідини.
У мясопептонно-печеночном бульйоні, на дні пробірки, з'являвся пластівчастий осад, що складався зі зрослих між собою пушинок.
Біохімічні властивості. Біохімічні властивості вивчалися шляхом посіву виділених культур актиноміцетів на середовища з вуглеводами, а також на просте й лакмусове молоко, желатин і пептонную воду. Дані дослідження проводилися на базі Кримської дослідної станції Національного наукового центра «Інститут експериментальної й клінічної ветеринарної медицини». Отримані результати лабораторних досліджень приводяться в таблиці 3.
Таблиця 3
Біохімічні властивості виділеної культури Actinomyces bovis
|
Група
|
Просте молоко
|
Лакмусове молоко
|
Лактоза
|
Сахароза
|
Глюкоза
|
Манніт
|
Желатин
|
Утворення H2S
|
Індол
|
|
1
|
Пептонізація
|
Пептонізація
|
─
|
─
|
─
|
─
|
─
|
─
|
─
|
|
2
|
Пептонізація
|
Пептонізація
|
─
|
─
|
─
|
─
|
─
|
─
|
─
|
|
3
|
Пептонізація
|
Пептонізація
|
─
|
─
|
─
|
─
|
─
|
─
|
─
|
Дослідження по вивченню біохімічних властивостей виділених нами культур актиноміцетів показали, що біохімічні властивості в них виражені слабко.
Більша кількість культур не ферментує лактозу, глюкозу, сахарозу й маннит. Молоко просте й лакмусове пептонизируется, але лакмусове молоко не змінює цвіт. Деякі культури розріджують желатин і виділяють сірководень, а частина культур сірководень не виділяє й не розріджує желатин.
На підставі проведених нами досліджень ми вважаємо за можливе віднести культури актиноміцетів 1-й, 2-й і 3-й груп до сімейства Actiomyceae, до роду Actinomyces, вид Actinomyces bovis.
Очевидно, культури 1-й групи, внаслідок мінливості їх в організмі хворих тварин, відрізняються від 2-й і 3-й груп деякими особливостями.
Всі культури актиноміцетів, виділені від хворих актиномікозом тварин, мають слабко виражені біохімічні властивості, але деякі з них виділяють протеолитический фермент і сірководень.
Після ідентифікації збудника захворювання, нашою основною метою й завданням було визначити чутливість збудника актиномікозу Actinomyces bovis до антибактеріальних препаратів і встановити його мінімальну концентрацію, що гнітить ріст цього мікроорганізму.
З метою з'ясування можливості застосування найбільш ефективних антибіотиків при лікуванні актиномікозу великої рогатої худоби нами було вивчено фунгістичну дію антибактеріальних препаратів в ін'єкційних формах, таких як цефтриаксон (цефолоспорини III покоління), бровасептол (сульфаніламідні препарати), а також препарат фторхінолонового ряду - енрофлокс.
Бровасептол. Механізм дії сульфаніламідів і триметоприма полягає в блокуванні двох різних етапів біосинтезу фоллиевой кислоти. Це приводить до придушення росту бактерій, припиненню їхнього розмноження й загибелі.
Препарат активний проти грамположительных і грамотрицательных мікроорганізмів.
Енрофлокс 5%. Антибіотик ставиться до групи фторхинолоновых препаратів. Гальмує активний фермент гіразу, що бере участь у каталізі ДНК мікробної клітини, у результаті чого наступає швидка бактерицидна дія, особливо на мікроорганізми, резистентні до β-лактамних антибіотикам, тетрациклінам, макролидам і аминогликозидам. Препарат ефективний проти грампозитивних і грамнегативних мікроорганізмів.
Цефтріаксон. Напівсинтетичний антибіотик групи β -лактамів, цефалоспорин III покоління, має бактерицидний ефект, механізм дії якого пов'язаний із пригнобленням активності ферменту трансептидази, порушенням біосинтезу пептидоглікана клітинної стінки мікроорганізму. Препарат має широкий спектр дії: активний щодо аеробних грамположительных мікроорганізмів, факультативних анаеробів, грамнегативних мікроорганізмів.
З антибактеріальних препаратів in vitro готовили робочі розведення таким чином, щоб у першій пробірці концентрація препарату склала 400 мкг/мол; у другий - 200 мкг/мл; у третьої - 100 мкг/мл; у четвертої - 50 мкг/мл; у п'ятої - 25 мкг/мл; у шостий - 12,5 мкг/мл.
Також матеріалом для досліджень служила 4-х добова бульйонна культура збудника захворювання, що була виділена від лабораторних тварин (білі миші) у результаті проведення ряду досвідів по експериментальному відтворенню актиномікозу великої рогатої худоби. Бульйонну культуру розводили у фізіологічному розчині до концентрації мікробних клітин 5×106/мл. Крім бульйонної культури, у досвіді також використався матеріал, що був отриманий з актиномикомы корови, хворий актиномікозом. Уміст актиномикозного вузла досліджували, як на присутність самого збудника безпосередньо, так і на супутню мікрофлору, що практично завжди є присутнім у вмісті патологічного матеріалу.
Для визначення чутливості збудника захворювання використали метод серійних розведень на щільному живильному середовищі [14,15]. Як живильне середовище застосовували агар Сабуро. Приготовлений основний розчин антибіотиків розводили в щільному живильному. середовищі Для цього розплавлений і охолоджений до 55 ˚С агар розливали по 18 мл у широкі колби й сюди ж додавали по 2 мол відповідні розведення випробуваного антибіотика, ретельно перемішували й переливали в чашки Петрі. У контрольну чашку Петрі розчин антибіотиків не додавався. Після підсушування в термостаті в плині 1-го години на поверхню живильного середовища здійснювали посів культури й первинного матеріалу за допомогою бактеріальної петлі. Результати поставлених досвідів ураховували через 72 ч інкубації при 37˚С. МПК (мінімальна гнітюча концентрація) визначали як найнижчу концентрацію антибіотика (у мікрограммах / мілілітр), яка повністю пригнічує ріст культури Actinomyces bovis.
Дані проведених досліджень представлені в таблицях №№ 4, 5, 6. Отримані результати показали, що культура Actinomyces bovis виявилася високочутлива до енрофлоксу 5%. Мінімальна пригнічуюча концентрація даного препарату склала 12,5 мкг/мл, у трохи меншому ступені до бровасептолу, МПК якого склала від 25 мкг/мл до 50 мкг/мл. И найменша чутливість культури виявилася до цефтріаксону.
Таблиця 4
Визначення мінімальної пригнічуючої концентрації Енрофлокса 5% до культури Actinomyces bovis
ЭНРОФЛОКС 5%
|
|
У посівів
|
У днів
|
Концентрація препарату мкг/мл
|
|
400
|
200
|
100
|
50
|
25
|
12,5
|
|
Ι посів
|
1
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
|
2
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
|
3
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
+
|
|
ΙΙ посів
|
1
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
|
2
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
|
3
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
+
|
Примітка :«-» - відсутність росту на живильних ;
«+» - наявність росту на живильних.
Як видно з вищенаведеної таблиці поява зросту колонії актиноміцетів, під дією енрофлоксу, почали з'являтися лише на третій день проведення досліду і тільки при мінімальній концентрації препарату.
Таблиця 5
Визначення мінімальної пригнічуючої концентрації Бровасептола до культури Actinomyces bovis
БРОВАСЕПТОЛ
|
|
У посівів
|
У днів
|
Концентрація препарату мкг/мл
|
|
400
|
200
|
100
|
50
|
25
|
12,5
|
|
Ι посів
|
1
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
|
2
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
+
|
|
3
|
-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
+
|
|
ΙΙ посів
|
1
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
|
2
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
+
|
|
3
|
-
|
-
|
-
|
-
|
+
|
+
|
Примітка :«-» - відсутність росту на живильних ;
«+» - наявність росту на живильних.
Щодо бровасептолу то його бактерицидна дія трохи слабша ніж у енрофлоксу це видно з таблиці 5. Ріст актиноміцетів вже з другого дня при концентрації 12,5 мкг/мл, і на третій день ріст колоній помітний при концентрації 50 мкг/мл. Але все ж таки, якщо ці результати порівняти з результатами наведеними в таблиці 6, то їх також можна вважати позитивними.
Таблиця 6
Визначення мінімальної пригнічуючої концентрації Цефтріаксону до культури Actinomyces bovis
ЦЕФТРИАКСОН
|
|
У посівів
|
У днів
|
Концентрація препарату мкг/мл
|
|
400
|
200
|
100
|
50
|
25
|
12,5
|
|
Ι посів
|
1
|
-
|
-
|
+
|
+
|
+
|
+
|
|
2
|
-
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
|
3
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
|
ΙΙ посів
|
1
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
+
|
|
2
|
-
|
-
|
+
|
+
|
+
|
+
|
|
3
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
Примітка :«-» - відсутність росту на живильних середовищах;
«+» - наявність росту на живильних.
Виходячи з результатів проведеної роботи видно, що збудник актиномікозу найменш чутливий до цефтриаксону. Слабка чутливість культури Actinomyces bovis до цефтріаксону обумовлюється тим, що цефтриаксон ставитися до групи β-лактамных антибіотиків. Отримані нами дані погодяться з результатами досліджень американського дослідника Bryan L. E. [16], що встановив низьку лікарську чутливість актиноміцетів до β - лактамным, аміноглікозидним антибіотикам і тетрациклінам. Пояснюється це наявністю генів антибіотикоустойчивости локализующихся на хромосомі й плазмідах.
У результаті проведених досліджень установлено, що найбільш ефективним препаратом що володіє бактерицидною дією на культуру Actinomyces bovis є енрофлокс, МПК якого становить 12, 5 мкг/мол. Найменш ефективний антибіотик у цьому випадку – цефтріаксон.
Список використаної літератури:
1. Аравийский А. Н. Вестн. вен. и дерм., 1950.- №6. – стр.41.
2. Голиков А. В. Актиномикоз крупного рогатого скота и антибиотикотерапия этого заболевания: Автореф. дис…канд. вет. наук/ ВИЭВ. – М.: Московская ветеринарная академия. - 1963. – С.14.
3. Сутеев Г. О. Актиномикоз (морфология, клиника, терапия). – М. – 1951.
4. Benveniste R., Davies J. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1973. – v.70. – p.276 - 280
5. Осповат В. Л. Актиномикоз в хирургической клинике. – Медгиз. – 1950.
6. Keefer C. S., Alake F. G., Marshall E. K. Penicillium in the treatment of iinfections. – a report of 500 cases. J. amer. Med. Assoc., 1943. – v.122. – 1217.
7. Bawden F. Gen. Rept Rothamsted Exptl. Stat.- 1962.- 30
8. Cornelisse J. L., Kleurlng der kolfjes, met behulp van cottonblue, in uitstrijkprepareten van actinotycotischs aandoeningen. - Tijdschr Diergeneesk., 1972, r. 97, N 14, p. 834-36. – Bibliogr: 9 tit. - Summary in English.
9. Аснин Д. И., Фирюкова М. В. Серодиагностика актиномикоза // ЖМЭИ. – 1955. - №1. – С.56 – 60.
10. Аснин Д. И., Сутеева Т. Г. Лечение шейно-лицевого актиномикоза биомицином (хлортетрациклином).// Советская медицина. – 1960. - №2. – С.117 – 120.
11. Маминов Л. С., Павлов И. В. Сравнительная эффективность методов лечения актиномикоза крупного рогатoro скота. - Сб, ст. / Дон. СХИ, 1981, т. 16, вып. 2, с. 66 - 68.
12. Волотко И. И. Классификация актиномикоза челюстно-лицевой области у крупного рогатого скота.// Ветеринария. – 1995. - №2. – С.26 – 27.
13. Зюбан В. И. К вопросу этиологии актиномикоэа крупного рогатого скота. - Учен. зап. Кабард.-Балкар. ун-та, 1972, вып. 38, т. 2, с. 51-52.
14. Добрица С. В. Множественная устойчивость к антибиотикам актиномицетов из клубеньков и ризосферы ольхи //Антибиотики. - №7. – 1982 – С.31 – 36.
15. Костенко Т. С., Радионова В. Б., Скородумов Д. И. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии. – М.: Колос. – 2001. – 344с.
16. Bryan L. E. Plasmids and Transposons. Environmental Effects and Maintenance Mecanisms. – New York. – 1980. – p.57 – 80
